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INVESTIGACION

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PROGRAMA DE MEDICINA DE PRECISIÓN DE ONCOLOGÍA PEDIÁTRICA
Equipo de investigación

Javier Alonso (Investigador principal, Jefe de grupo) - Cristina Robledo (Investigadora postdoctoral)

Institución

Laboratorio de Tumores Sólidos Infantiles. Instituto de Investigación de Enfermedades Raras. Instituto de Salud Carlos III. Ctra. Majadahonda-Pozuelo Km 2, 28220 Majadahonda, Madrid. Tlfno: 91 822 32 17. Email: fjalonso@isciii.es

Introducción

El cáncer infantil es la primera causa de muerte por enfermedad en los países industrializados. De acuerdo con los datos del registro estatal de tumores infantiles (RETI) de la Sociedad Española de Hemato-Oncología Pediátrica (http://www.sehop.org) en España se diagnostican más de 1500 casos anuales. La supervivencia de los pacientes con cáncer infantil en España ha aumentado progresivamente durante las dos últimas décadas, hasta situarse en el momento actual en niveles equiparables a los del resto de países de nuestro entorno socioeconómico.

Hoy en día sabemos que el cáncer es una enfermedad genética y muy heterogénea, no ya entre diferentes tipos tumorales, si no lo que es más importante aún, entre tumores del mismo tipo, e incluso entre las células del mismo tumor. Por esta razón, pacientes con tumores muy similares desde un punto de vista clínico pueden responder de manera muy diferente al tratamiento. En consecuencia, un conocimiento más profundo de las características genéticas del tumor favorecerá la identificación de tratamientos más específicos, es decir, personalizados para cada paciente y tumor. Gracias a las modernas técnicas de secuenciación masiva hoy es posible caracterizar el genoma del tumor con un detalle sin precedentes a un coste asumible y aplicar la información así obtenida en el entorno clínico.

El objetivo principal de este proyecto ha sido poner a disposición de los hemato-oncólogos pediatras la posibilidad de realizar estudios genéticos complejos que pudieran serles útiles en el tratamiento de niños con cáncer.

Objetivos

Objetivo general

El objetivo principal de este proyecto es facilitar el acceso a los pacientes con cáncer infantil, a la denominada medicina personalizada o de precisión.

Objetivos específicos

Los objetivos específicos del proyecto han incluido

1) El análisis genético-molecular de los tumores de los niños con cáncer mediante tecnologías de secuenciación masiva de ADN de última generación.

2) La confirmación y validación de las alteraciones identificadas mediante técnicas alternativas (secuenciación Sanger).

3) La integración de la información genético-molecular con la información disponible en otras bases de datos (farmacológicas, de ensayos clínicos, etc…) para identificar dianas susceptibles de tratamientos personalizados.

4) La generación de los informes genéticos para dar a conocer los hallazgos obtenidos al médico solicitante del estudio.

En la siguiente figura se resumen las diferentes fases desarrolladas, desde el paciente hasta la generación del informe y eventualmente el empleo o recomendación de uso de una terapia dirigida.

Resumen de los resultados más relevantes

Este proyecto de investigación es un estudio colaborativo multidisciplinar con varios hospitales españoles. Hasta junio de 2018 se han estudiado un total de 65 pacientes procedentes de los hospitales Niño Jesús, Gregorio Marañón y La Paz de la Comunidad de Madrid, así como de otros hospitales de San Sebastián, Bilbao, Granada, Burgos o Murcia.

La serie incluye tanto tumores hematológicos como sólidos. De los 65 pacientes estudiados un 34% corresponden a leucemias (22 de 65), un 38% a sarcomas (25 de 65) y un 28% (18 de 65) a otros tipos de cáncer como los tumores del sistema nervioso central.

Los estudios de secuenciación masiva se han llevado a cabo con un panel de 160 genes frecuentemente mutados en cáncer. Se han identificado mutaciones en un total de 33 genes diferentes.

Estos estudios nos han permitido:

Identificar mutaciones clínicamente relevantes en el 40% de los tumores analizados. Por ejemplo, en la leucemia aguda linfoblástica infantil se han detectado mutaciones en los genes IKZF1, NOTCH1, WT1, TP53, NF1, KRAS, NRAS, PTEN, BRIP1, que corresponden a genes implicados en el desarrollo de este cáncer.

En varios de los casos se han encontrado mutaciones que se asocian al uso de determinados fármacos. Por ejemplo, se han encontrado mutaciones en KRAS/NRAS (potencialmente tratable con p.ej. Trametinib); PTEN (Everolimus); FLT3 (Sorafenib); ERBB2 (Trastuzumab); PIK3CA (Everolimus). Esta información es valorada por el clínico para el eventual uso de alguna terapia dirigida.

En algunos casos los estudios de secuenciación masiva han contribuido al diagnóstico diferencial del tumor. Por ejemplo, un tumor con mutaciones en CTNNB1 contribuyó a diagnosticar dicho tumor como una fasciitis craneal.

Identificar portadores de mutaciones germinales en genes de predisposición al cáncer (p. ej. DICER1, TP53 o NF1). Hemos encontrado alteraciones en genes que predisponen al cáncer en aproximadamente el 10% de los pacientes estudiados. Está información es especialmente importante ya que permite identificar pacientes que tienen un riesgo incrementado de desarrollar cáncer, no solo ya en la edad pediátrica, sino también en la edad adulta, facilitando así el diagnóstico precoz y la implementación de medidas y hábitos de vida preventivos en la medida de lo posible.

Conclusiones

El estudio genético de los cánceres infantiles mediante técnicas de secuenciación de ADN de última generación ha permitido obtener información muy relevante que puede ser utilizada en beneficio del paciente.

Este proyecto ha demostrado que este tipo de estudios es técnicamente factible y que existe un interés creciente por los médicos para realizarlos.

Resultados de investigación (publicaciones)

Durante el desarrollo del proyecto se han presentado los resultados en varios congresos nacionales e internacionales.

Nos gustaría destacar aquí el premio obtenido a la mejor comunicación oral en el último congreso nacional de la Sociedad Española de Hemato-Oncología Pediátrica celebrado en Alicante en mayo de 2018.

IMPLEMENTATION OF A PRECISION MEDICINE PROGRAM IN PEDIATRIC ONCOLOGY. RESULTS OF THE PILOT STUDY.

Cristina Robledo Montero1, Carlos Rodríguez-Martín2, Gema Gómez-Mariano2, Ana Sastre3, Jose Juan Pozo-Kreilinger4, Cristina Mata5, Jorge Huerta5, Manuel Ramírez6, Daniel Azorín7, Javier Alonso1

1Unidad de Tumores Sólidos Infantiles. Instituto de Investigación de Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda (MADRID) España

2Servicio de Diagnóstico Genético. Instituto de Investigación de Enfermedades Raras, ISCIII (Madrid) España

3Servicio de Hemato-Oncología Pediátrica. Hospital Universitario La Paz (Madrid) España

4Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Universitario La Paz (Madrid) España

5Sección de Oncohematología infantil, Servicio de pediatría. Hospital General Universitario Gregorio Marañón (Madrid) España

6Servicio de Oncología, Hospital Universitario Niño Jesús (Madrid) España

7Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Niño Jesús (Madrid) España

Comunicación tipo poster presentada en el congreso de la European Association for Cancer Research EACR-AACR-SIC, Florencia, Italia, 2017

A BILINEAL ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA ORIGINATING AT A COMMON LYMPHOID PROGENITOR

África González-Murillo1, Carmen Sánchez-Valdepeñas1, Cristina Robledo2, Ana Castillo1, Lorea Abad1, Carmen Hernández1, David Ruano1, Luís Madero1, Javier Alonso2, Manuel Ramírez1.

1Pediatric Hematology & Oncology, Hospital Universitario Niño Jesus, Madrid,

2Instituto de Investigación en Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Spain

Comunicación tipo poster presentada en el 22 Congress of the European Hematology Association (EHA). Madrid 2017

IMPLEMENTACIÓN DE UN PROGRAMA DE MEDICINA DE PRECISIÓN EN ONCOLOGÍA PEDIÁTRICA. RESULTADOS DE UN ESTUDIO PILOTO

Cristina Robledo Montero1, Carlos Rodríguez-Martín2, Gema Gómez-Mariano2, Ana Sastre3, Jose Juan Pozo-Kreilinger4, Cristina Mata5, Jorge Huerta5, Manuel Ramírez6, Daniel Azorín7, Javier Alonso8

1Unidad de Tumores Sólidos Infantiles. Instituto de Investigación de Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda (MADRID) España

2Servicio de Diagnóstico Genético. Instituto de Investigación de Enfermedades Raras, ISCIII (Madrid) España

3Servicio de Hemato-Oncología Pediátrica. Hospital Universitario La Paz (Madrid) España

4Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Universitario La Paz (Madrid) España

5Sección de Oncohematología infantil, Servicio de pediatría. Hospital General Universitario Gregorio Marañón (Madrid) España

6Servicio de Oncología, Hospital Universitario Niño Jesús (Madrid) España

7Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Niño Jesús (Madrid) España

8Unidad de Tumores Sólidos Infantiles. Instituto de Investigación de Enfermedades Raras, ISCIII (Madrid) España

Comunicación oral presentada en el I Congreso Interdisciplinar de Genética Humana. Madrid. 2017

IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES GERMINALES EN GENES DE PREDISPOSICIÓN AL CÁNCER EN PACIENTES CON CÁNCER PEDIÁTRICO MEDIANTE SECUENCIACIÓN MASIVA DE PANELES DE GENES

Cristina Robledo Montero1, Cristina Mata2, Manuel Ramírez3, Ana Sastre4, Javier Alonso1

1Unidad de Tumores Sólidos Infantiles. Instituto de Investigación de Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda (MADRID) España

2Sección de Oncohematología infantil, Servicio de pediatría. Hospital General Universitario Gregorio Marañón (Madrid) España

3Servicio de Oncología, Hospital Universitario Niño Jesús (Madrid) España

4Servicio de Hemato-Oncología Pediátrica. Hospital Universitario La Paz (Madrid) España

5Unidad de Tumores Sólidos Infantiles. Instituto de Investigación de Enfermedades Raras, ISCIII (Madrid) España

Comunicación oral presentada en el XI Congreso de la Sociedad Española de Hematología y Oncología Pediátricas (SEHOP). Alicante, 2018.

Primer premio a la mejor comunicación oral

Desarrollo futuro del proyecto

El proyecto de investigación desarrollado durante estos años ha demostrado ser de gran utilidad para los hemato-oncólogos pediátricos. Como prueba de ello se adjunta una carta de apoyo del equipo de oncólogos infantiles del Hosp. Gregorio Marañón (se pueden solicitar cartas de apoyo de otros hospitales colaboradores si se considera necesario).

En consecuencia, nuestro primer objetivo es consolidar el trabajo realizado hasta ahora, incorporando nuevas técnicas que nos permitan profundizar más en las bases genéticas del cáncer infantil.  A continuación se describen los objetivos concretos a desarrollar en el próximo año.

1) Continuar con los estudios de secuenciación masiva en muestras tumorales, incrementando progresivamente el número de hospitales que puedan beneficiarse de estas determinaciones y en consecuencia el número de pacientes.

2) Implementar el uso de la biopsia líquida como método de diagnóstico no invasivo.   La biopsia líquida consiste en la identificación de las alteraciones genéticas del tumor en una muestra de sangre. Este abordaje está ya siendo de utilidad en el cáncer  de adultos pero está aún poco desarrollado en cáncer infantil. La identificación de las alteraciones   genéticas específicas de cada tumor en las muestras de biopsia líquida nos permitirá hacer un seguimiento de las mismas en el plasma y valorar la utilidad de estas determinaciones como marcador de respuesta al tratamiento e incluso como biopsia diagnóstica, especialmente en aquellos casos en que el acceso al tumor primario es complicado (p. ej. tumores cerebrales).

3) Desarrollar e implementar tecnologías más sensibles, rápidas y menos costosas para la identificación de mutaciones presentes en una baja proporción de las células del tumor. Los tumores son muy heterogéneos, de tal manera que las diferentes células del tumor pueden tener diferentes alteraciones genéticas y cada una de esas células tiene una respuesta al tratamiento diferente. La identificación de las células que pueden ser resistentes al tratamiento es de vital importancia para establecer la terapia más adecuada. La incorporación de estas tecnologías más sensibles como la PCR digital nos permitirá identificar caracterizar con más fiabilidad las mutaciones que se encuentren en un bajo porcentaje de las células del tumor, de manera que será posible detectar subpoblaciones de células tumorales emergentes.

Medios propios disponibles para desarrollar el proyecto

El laboratorio del investigador principal cuenta con un equipamiento completo para la realización de todas las técnicas de biología molecular y celular propuestas en el proyecto como cabinas de bioseguridad (1) y de PCR (1), nanodrop (1), centrífugas y microcentrífugas (4), termocicladores (4), termociclador PCR tiempo real (RG6000 Qiagen), termobloques (2), fuentes de electroforesis (3), cubetas electroforesis (2) y equipos de transferencia (2) neveras y congeladores (3), ultracongeladores (1).

Además, el departamento dispone de equipamiento de uso común que incluye lector de placas Tecan Infinite M200 (1) (para absorbancia, fluorescencia y luminiscencia), fodocumentadores de fluorescencia (2) (BioRad GelDoc 2000, DNR MiniBis Pro) y luminiscencia-ECL (1) (BioRad ChemiDoc XRS+), PCR cuantitativa (Roche Light Cycler 1.5), centrífugas (2) (Sorvall RC5C, Beckmann Avant J-301) y ultracentrífugas (1) (Beckman Optima XPN) con sus correspondientes rotores, citómetro de flujo (MACSQuant Analyzer, Miltenyi), microscopios de fluorescencia (2) (Xeiss AXIO ImagerX1, Axiovert 40CFL), Nanosight NS300 para la caracterización de exosomas, y dos cuartos de cultivo de uso compartido perfectamente equipados, uno de ellos dedicado exclusivamente al trabajo con virus.

Por último, en el campus contamos con una serie de servicios comunes de apoyo a la investigación:

– Unidad de Genómica: Dispone de un secuenciador capilar (ABI 3730XL), dos equipos de PCR cuantitativa (ABI 7500FAST, Roche LC480), 1 secuenciador MiSeq (Illumina), 1 secuenciador NextSeq500 (Illumina) y equipamiento asociado.

– Unidad de microscopia confocal dotada con un microscopio Leica TCS SP5 y sistema para estudios in vitro con control de temperatura, CO2 y humedad.

– Unidad de microscopia electrónica dotada con un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai 12.

– Animalario que cuenta con instalaciones para la cría de animales de experimentación (ratones, conejos y coballas) y experimentación en condiciones SPF. Cuenta con un equipo de imagen in vivo IVIS Lumina 3XR (luminiscencia, fluorescencia y rayos X)

– Unidad de bioinformática con una completa infraestructura informática.

El centro cuenta con instalaciones autorizadas por el Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente para realizar actividades con Organismos Modificados Genéticamente tipo 2 (nº autorización A/ES/14/I-06)